style="width:3.21998in;height:0.70664in" /> … ……………… (C.1) 本文是学习GB-T 33420-2016 压力蒸汽灭菌生物指示物检验方法. 而整理的学习笔记,分享出来希望更多人受益,如果存在侵权请及时联系我们
本标准规定了压力蒸汽灭菌生物指示物的检验方法。
本标准适用于压力蒸汽灭菌生物指示物的检验。
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件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB18281.1 医疗保健产品灭菌 生物指示物 第1部分：通则
GB/T 24628 医疗保健产品灭菌 生物与化学指示物 测试设备
消毒技术规范(2002年版)卫生部
下列术语和定义适用于本文件。
3.1
生物指示物 biological indicator;BI
对指定条件下的特定灭菌程序具有一定抗力，并装在内层包装中可供使用的染菌载体。
3.2
载体 carrier
试验微生物的支持物。
3.3
存活时间 survival time;ST
在规定的条件下暴露于杀菌因子，试验的生物指示物中微生物存活的最长时间。
3.4
杀灭时间 killing time;KT
测定生物指示物抗力时，受试样本经杀菌因子作用后，全部无菌生长的最短作用时间。
3.5
D 值 D value
在设定的暴露条件下，杀灭特定试验微生物总数的90%所需的时间。
3.6
存活曲线 survivor curve
在固定的灭菌因子作用下，微生物的存活情况与暴露变化的关联曲线。
3.7
生物指示物抗力测试仪 biological indicator evaluator
resistometer
产生限定条件下灭菌过程中物理化学变化规定组合，以测量抗力的专用设备。
GB/T 33420—2016
用于制作压力蒸汽灭菌生物指示物的菌株为嗜热脂肪杆菌芽孢(Geobacillusstearothermophilus
ATCC7953 或 SSI K31)或被证明具有本标准所要求的同等性能的微生物。
回收菌量大于等于1×10⁵ CFU/ 片或大于等于1×10⁵ CFU/
支，对于成品的指示物，载体回收的菌
量与说明书上的菌量误差在一50%～+300%之间，悬液回收的菌量与说明书上的菌量误差在±35%。
测定菌量时，应最少测试4个样本，具体检测方法参见附录A。
测试抗力时应使用生物指示物抗力测试仪，生物指示物抗力测试仪要求见 GB/T
24628。 在121℃ 时，D 值的要求：D 值大于或等于1.5 min,
对于成品的指示物，测试的 D 值应在说明书上的D 值
±20%的范围内。应至少使用下列2种方法进行测试：
a) 存活曲线法测试D 值，参见附录 B;
b) 部分阴性法测试D 值，参见附录C;
c) 验证法测试D 值，将 a)或者 b)测试出的 D
值和4.1.2的回收菌量的平均数带入式(1)和 式(2),计算出ST 值和 KT
值。参照附录D 进行验证：
ST≥(logN。 -2)×D 值 (1)
KT≤(logN。+4)×D 值 (2)
式中：
N。 ——每批生物指示物的回收菌量的平均数。
在121℃时，ST 值的要求：大于或等于4.5 min;KT 值的要求：小于或等于24
min。
符合 GB18281.1 的要求。
4.3.1 恢复培养基应满足下列要求：
a) 使10 CFU～100 CFU 的微生物恢复生长；
b) 使损伤的微生物恢复生长；
c) 经过压力蒸汽灭菌后不会产生抑制微生物生长的物质。
每个样本的恢复培养基中，接种10 CFU～100 CFU
的嗜热脂肪杆菌芽孢(ATCC7953), 同时设置
阴性对照和阳性对照，培养至规定时间后观察有无嗜热脂肪杆菌芽孢生长(一般观察培养基的颜色变
化)。如果恢复培养基有菌生长，并且阴性对照无菌生长和阳性对照有菌生长，判断恢复培养液合格。
取包装完好的同批次生物指示物放置于制造商建议的保存条件下，存放至标签和说明书规定的有
效期限，取出再次进行评价，生物指示物应符合4.1、4.2和4.3的要求。
GB/T 33420—2016
(资料性附录)
活菌培养计数方法
A.1 取含有10 mLTPS(0.1%
胰蛋白胨的生理盐水溶液)的无菌试管，加入适量无菌玻璃珠，将计数菌
片投入试管，用电动混合器混合，到菌片被完全打碎，制成菌悬液。
A.2 将试管按需要数量分组排列于试管架上，每管加入4.5 mLTPS。
各组由左向右，逐管标上10-1、
10-2、10-3……等。
A.3 将菌悬液用电动混匀器混合20 s,或在手掌上用力振打80次，随即吸取0.5 mL
加至10¹管内。 A.4 将10- 1管依前法用电动混匀器混合20
s,或在手掌上用力振打80次，混匀，再吸取出0.5 mL 加
入10-2管内。如此类推，直至最后一管。必要时，还可作某稀释度的1:1或1:4稀释。
A.5 选择适宜稀释度试管(以预计生长菌落数每平板为15 CFU～300 CFU
者为宜),吸取其中混合均
匀的悬液1.0 mL 加于无菌平皿内。每一稀释度接种2个平皿。
一般需接种2个～3个不同稀释度。
A.6
将40℃~45℃熔化的嗜热脂肪杆菌芽孢恢复培养基参见《消毒技术规范(2002年版)》,倾注于已
加入样液的平皿中，每平皿15 mL～20 mL。
A.7
将平皿盖好，即刻轻轻摇动混匀，平放。待琼脂凝固后，翻转平皿使底向上，置56℃±2℃恒温培
养箱内培养。
A.8 培养至72 h,计数菌落数。
一般以肉眼观察，必要时用放大镜检查。以每平板菌落数在30 CFU~
300 CFU 的稀释度为准记录结果。
A.9
根据稀释倍数和接种量计算每毫升菌液中或每一菌片(染菌载体)上的平均菌落数。
A.10 菌液计数从 A.3 步骤开始操作。
GB/T 33420—2016
(资料性附录)
存活曲线法测试 D 值
B.1 随机抽取50个样本。
B.2
根据不同的暴露温度设置10个暴露时间点，每个时间点测试5个样本，最短的暴露时间可以设定
为 0 s,最长的暴露时间使菌量减少到小于或等于初始菌量的0.01%。
B.3 测试之前，首先对生物指示物抗力测试仪进行预热。
B.4
按照生物指示物抗力测试仪操作说明书的流程进行操作，分别对10个暴露时间分别处理。
B.5 处理完毕，参照附录A 对各组样本随机抽取3个进行活菌计数。
B.6 用所得的全部存活菌数的常用对数值，对时间(min)
作图，用最小二乘法进行回归分析，确定最佳
线性曲线。回归分析时不应包括原先菌落数0.5log
范围内的存活数据点。计算所得直线斜率的负倒
数值，即等于以分钟表示的指定暴露条件下的 D
值，同时所得线性曲线相关系数应不小于0.8。
GB/T 33420—2016
(资料性附录)
部分阴性法计算D 值
C. 1 随机选取120个样本。分成6组，每组20个样本。
C.2 生物指示物抗力测试仪参数设置：
a) 暴露温度设置121℃;
b)
暴露时间至少为6个时间点，至少1个时间点全部有菌生长，至少2个时间点部分有菌生长，
至少2个时间点全部无菌生长。
C.3 对6组样本分别暴露。
C.4
暴露完成后将6组生物指示物在56℃±2℃温度下，按照说明书要求培养到规定时间，记录阴性
和阳性结果。当最短暴露时间点全部为阳性，最长暴露时间全部为阴性，并且中间至少2组有部分样本
阳性，试验结果有效，带入式(C. 1) 和式(C.2) 计算 D 值。
C.5 Limited Spearman-Karber 法(LSKP),
达到无菌生长平均时间的计算见式(C. 1):
style="width:3.21998in;height:0.70664in" /> … ……………… (C.1)
D 值的计算见式(C.2):
style="width:2.74012in;height:0.66in" /> ………… ……… (C.2)
式中：
UHsk — 达到无菌生长平均时间，单位为秒(s);
Uk —— 首次显示所有样本无菌生长的暴露时间，单位为秒(s);
d — 暴露时间的固定间隔，单位为秒(s);
n —— 每组的样本量，单位为个；
r; —— 每次暴露无菌样本数量，单位为个；
N 。 — 回收菌落数，单位为 CFU;
0.2507—— 计算系数。
GB/T 33420—2016
(资料性附录)
验证法测试D 值
D.1 ST 值验证
将50个试验样本放入压力蒸汽灭菌生物指示物抗力测试仪中，作用浓度为2.3
mg/L±0.4 mg/L, 在50℃±0.5℃时，暴露时间设定为计算出的ST
值，暴露完成后，将50个生物指示物样本取出，置于
56℃±2℃培养至说明书规定时间。若全部有菌生长，则计算的 ST
值通过验证；若有样本无菌生长，
则计算的ST 值没有通过验证。
D.2 KT 值验证
将50个试验样本放入压力蒸汽灭菌生物指示物抗力测试仪中，作用浓度为2.3
mg/L±0.4 mg/L, 在50℃±0.5℃时，暴露时间设定为计算出的 KT
值，暴露完成后，将50个生物指示物样本取出，置于
56℃±2℃培养至说明书规定时间。若全部无菌生长，则计算的 KT
值通过验证；若有样本有菌生长，
则计算的 KT 值没有通过验证。
D.3 判 定
计算的ST 值和 KT 值都通过验证，则判定测出的D 值有效。
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